مطالعه بر روی آنزیم dna پلی مراز مقاوم به حرارت جداشده از چشمه های آبگرم ایران با استفاده از تکنیکهای جهش زایی هدایت شده جهت غربالگری آنزیمی با فعالیت اگزونوکلئازی 5-3

بررسی ساختار فضایی و هم ترازی توالی پروتئینی دومین اگزونوکلئازی 3-5 آنزیمهای dna پلیمراز i باکتری ترموفیل geobacillus sp.mkk نشان می دهد که اسیدآمینه های کاتالیتیک جایگاه فعال اگزونوکلئازی 3-5 تغییر کرده و آنزیم این فعالیت خود را از دست داده است. به منظور بازگرداندن این فعالیت به آنزیم با استفاده از روش جهش زائی نقطه ای اسیدآمینه های کلیدی و مهم در جایگاه فعال اگزونوکلئازی 3-5 جایگزین اسیدآمینه های متناظر در آنزیم mkk پلیمراز شد. 7 مولکول جهش یافته از این آنزیم ساخته شد که شامل مولکولهای m1 (v319d, e325l)، m2 (a376d)، m3 (d425f)، m4 (insy446, k450d)، m12 (v319d, e325l, a376d)، m123 (v319d, e325l, a376d, d425f) و m1234 (v319d, e325l, a376d, d425f, insy446, k450d) می باشد. بعلاوه یک مولکول هیبرید به نام mkkec نیز ساخته شد که در آن دومین اگزونوکلئازی 3-5 در آنزیم mkk با دومین مشابه در آنزیم dna پلیمراز i باکتری e.coli جا به جا شده بود. برای اولین بار تمامی اسیدآمینه های ضروری برای فعالیت اگزونوکلئازی 3-5 به یک مولکول جهش یافته وارد شد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که از میان تمامی مولکولهای جهش یافته تنها دو مولکول جهش یافته m1234 و mkkec دارای فعالیت اگزونوکلئازی 3-5 هستند. بعلاوه نتایج سنجش فعالیت آنزیمی نشان داد که آنزیم جهش یافته m1234 در مقایسه با آنزیم وحشی mkk پلیمراز فعالیت پلیمرازی خود را نسبتا حفظ کرده در حالیکه مولکول هیبرید mkkec کاهش فعالیت پلیمرازی را نسبت به آنزیم وحشی نشان میدهد.